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电泳仪的工作原理及组成部件

时间:2024-03-29 21:29:36 类别:电子仪器 浏览:1320次

  脉冲电泳仪-基础知识

  很多人可能已经用标准琼脂糖凝胶几百次了。它们非常适合于显示高达10 kb的小DNA片段,但是如果你想检查真正大的DNA片段甚至整个染色体呢?这就是脉冲场凝胶电泳(PFGE)的用武之地!虽然运行PFGE所需的设备比您通常使用的标准琼脂糖凝胶要复杂得多,但其概念基本相同。


  PFGE的工作原理

  类似于标准的电泳程序,DNA是通过一个PFGE凝胶由于电荷。原则上,仪器本身与标准电泳装置基本相同。与标准电泳类似,也有允许电荷通过室的电极。然而,在PFGE中,这些电极围绕在凝胶周围,并不是一下子全部激活。只有激活特定的电极才允许电流以特定的角度被调制。一种标准的凝胶通常只有几个小时的活性,而PFGE的运行可能需要几天的时间。为了保持缓冲温度降低,它在被反馈到腔室之前通过管子和冷却器。


  PFGE仪器

  一个PFGE设备的例子。PFGE中电极的排列使得如此大的DNA片段得以分解。当电流的角度来回切换时,DNA被左右移动,使得较大的DNA片段能够穿过凝胶基质pfge 2型作为单个PFGE循环的示例,箭头指示在某个脉冲周期内哪些电极是活动的。DNA在整个程序中以不同的角度被拉动,最终的结果是DNA缓慢地向凝胶底部移动。结果是一种琼脂糖凝胶,可以在手术结束时分解大片段的DNA,甚至完整的染色体。与您可能习惯的相反,PFGE程序并不像设置电压和走开那么简单。PFGE功率单元允许用户调节除电压外的各种运行条件,如脉冲角和缓冲温度。此自定义允许将运行程序调整为运行的特定类型的样本。超大样本(>MB)的运行条件与小样本不同,您应该根据样本类型调整条件拨进应优化以下组件以获得最佳结果:

  1.电压

  PFGE中的电压测量值为V/cm。我个人发现,大多数协议使用6V/cm作为标准,允许几百kb左右的样本得到很好的解析。如果使用的是大得多的样本(兆基),通常建议降低电压。小碎片的情况正好相反。

  2.脉冲角

  脉冲角是将要应用的电流之间的差角。大多数协议使用120°的角度;但是,这通常可以调整。例如,使用较小的角度来提高大碎片的分辨率,而较大的角度用于较小的碎片。不过,请记住,提高一种类型碎片的分辨率通常会以牺牲另一种碎片的分辨率为代价。

  3.切换时间

  开关时间对样品分辨率的影响最大。开关时间是指电流在任何一个方向上拉动的时间。对于小尺寸,使用较短的切换时间,对于较大的碎片使用较长的切换时间。正如你所料,许多样本将包含各种大小的DNA片段。要解决此问题,请将程序设置为在整个运行过程中更改切换时间。程序将在运行过程中将切换时间从短时间延长到较长时间,以补偿样本中的各种大小。


  4.温度

  DNA在凝胶中移动的时间不长,因为DNA在凝胶中移动的时间不长。因此,单次PFGE运行通常持续一夜,有时长达几天。这些长时间运行意味着在整个过程中必须保持缓冲温度,以防止过热。这是通过在运行期间通过冷却器泵送运行缓冲器来实现的。此外,有时您需要暂停运行并在当前缓冲区耗尽时添加新的缓冲区。如您所料,运行时间受缓冲区温度的影响。较低的温度意味着更长的运行时间,但通常是更高分辨率的倍。相反,温度越高,运行时间越短,但分辨率越低。



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